— Эбигейл Романо, гуманитарные и гуманитарные науки, выпуск 2018

— Кэти Гэллап, История, выпуск 2019 года

Купить N’s Collection Lassie Grey Coloured Контакты

Политика возврата

Полная политика возврата доступна на странице нашей службы поддержки клиентов.

Вы можете вернуть большинство новых неоткрытых товаров в течение 30 дней с момента доставки для получения полного возмещения.Мы также оплатим стоимость обратной доставки, если возврат является результатом нашей ошибки (вы получили неправильный или бракованный товар и т. Д.).

Вы должны рассчитывать на получение возмещения в течение четырех недель с момента передачи посылки отправителю, возвращающему посылку, однако во многих случаях вы получите возмещение быстрее.

Этот период времени включает в себя транзитное время, в течение которого мы получим ваш возврат от грузоотправителя (от 5 до 10 рабочих дней), время, необходимое нам для обработки вашего возврата после его получения (от 3 до 5 рабочих дней), и время, необходимое для его обработки. требует от вашего банка обработки нашего запроса на возврат (от 5 до 10 рабочих дней).

Если вам нужно вернуть товар, просто войдите в свою учетную запись, просмотрите заказ, используя ссылку «Завершить заказы» в меню «Моя учетная запись», и нажмите кнопку «Вернуть товар (ы)». Мы сообщим вам по электронной почте о вашем возмещении, как только мы получим и обработаем возвращенный товар.

Доставка

Мы можем отправить товар практически по любому адресу в мире. Обратите внимание, что существуют ограничения на некоторые товары, и некоторые товары не могут быть отправлены в другие страны.

Когда вы размещаете заказ, мы рассчитаем для вас даты отгрузки и доставки в зависимости от наличия ваших товаров и выбранных вами вариантов доставки.В зависимости от выбранного вами поставщика доставки, приблизительные даты доставки могут отображаться на странице сметы доставки.

Обратите внимание, что стоимость доставки для многих товаров, которые мы продаем, зависит от веса. Вес любого такого предмета можно узнать на его странице с подробными сведениями. Чтобы отразить политику транспортных компаний, которые мы используем, все веса будут округлены до следующего полного фунта.

Окончательный срок доставки и стоимость будут подтверждены при оформлении заказа до оплаты

Информацию о нашей политике доставки COVID-19 см. На этой странице: Наше обновление COVID-19

Для получения полной информации о доставке и возврате перейдите на эту страницу: Служба поддержки клиентов

Длинная некодирующая РНК LASSIE регулирует чувствительность к сдвиговому напряжению и функцию эндотелиального барьера

Культура клеток

HUVEC и эндотелиальные клетки пупочной артерии человека (HUAEC) были приобретены у Lonza и культивированы в среде EC ECM (ScienCell) с добавлением 5% эмбрионального теленка сыворотка (FCS, ScienCell), 1% пенициллин / стрептомицин (ScienCell) и добавка для роста эндотелия (ScienCell) или эндотелиальная базальная среда (EBM; Lonza) с добавлением EGM SingleQuots (Lonza) и 10% FCS (Invitrogen).Эндотелиальные клетки микрососудов выделяли из периферических тканей легкого, свободных от плевры, и эндотелиальных клеток легочной артерии из колец легочной артерии, как описано ранее ⁴⁸ , и культивировали в ECM. Клетки использовали для экспериментов до четвертого пассажа. Количество клеток определяли с помощью автоматического счетчика клеток (Countess II FL, Invitrogen).

Клетки HEK293T были приобретены в ATCC и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Lonza), с добавлением 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина и 1% пирувата.Клетки использовали до 35 пассажа для получения лентивирусных частиц.

Все типы клеток культивировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ и дали отрицательный результат на микоплазму.

Антитела, олигонуклеотиды и ингибиторы

Информация об антителах и олигонуклеотидах, использованных в этом исследовании, представлена ​​в дополнительных таблицах 1-2. Праймеры, ДНК-олигонуклеотиды и миРНК были приобретены у Sigma-Aldrich, LNA GapmeRs у Exiqon и зонды 2’O-Me-РНК у Integrated DNA Technologies.Ингибиторы протеаз и фосфатаз были приобретены у Roche, а ингибиторы РНКаз — у Thermo Scientific.

Трансфекция клеток и стимуляция

HUVEC были трансфицированы при 60-70% слияния с LNA GapmeR или siRNA с использованием Lipofectamine RNAiMax (Thermo Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Нокодазол (350 нМ, Sigma-Aldrich) и Z-VAD-FMK (50 мкМ, Selleckchem) разбавляли в соответствующей среде для стимуляции HUVEC.

5 ‘и 3’ RACE (быстрая амплификация концов кДНК)

Варианты транскриптов LncRNA были идентифицированы с помощью 5 ‘и 3′ RACE с использованием набора для амплификации кДНК SMARTer ™ RACE (Clontech) в соответствии с протоколом производителя.Вкратце, РНК HUVEC, сверхэкспрессирующих KLF2, подвергали обратной транскрипции с использованием специфических праймеров для связывания 5′- или 3′-концов. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для 5′- и 3’-ПЦР RACE с ген-специфическими праймерами. Очищенные гелем продукты ПЦР RACE секвенировали напрямую или клонировали в вектор pJET1.2 / blunt (набор для клонирования CloneJET PCR, Thermo Scientific) в соответствии с протоколом производителя и впоследствии секвенировали. Секвенирование выполняли с помощью Eurofins Genomics

Лентивирусные конструкции

Для сверхэкспрессии лентивируса последовательность варианта 1 транскрипта LASSIE (дополнительная таблица 3) клонировали в вектор pLenti4 / V5-DEST ™ Gateway ™ (Thermo Scientific).Лентивирусные частицы получали трансфекцией клеток HEK293T вирусными упаковывающими плазмидами pCMVΔR8.91, pMD2.G и плазмидой pLenti4 / V5-DEST-LASSIE с использованием реагента для трансфекции GeneJuice ^® (Merck Millipore). Пустой pLenti4 / V5-DEST ™ использовали в качестве контроля. Супернатанты собирали через 48 и 72 ч после трансфекции и концентрировали центрифугированием (690 × г, , 4 ° C) с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra-15 (Merck Millipore). Долговременную сверхэкспрессию VE-Cadherin-GFP ^{, 49,} или KLF2, а также опосредованное shRNA сайленсинг KLF2 ¹ проводили, как описано ранее.HUVEC, обработанные лентивирусом для сверхэкспрессии LASSIE, промывали средой через 24 часа после трансдукции вируса. Эксперименты проводили через 72 ч после трансдукции вируса.

Выделение РНК и RT-qPCR

Тотальную РНК из культивированных HUVEC выделяли и расщепляли ДНКазой с использованием набора Direct-zol RNA miniprep (Zymo Research). 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза кДНК iScript ™ (Bio-rad). кДНК разводили до конечной концентрации 5 нг / мкл (предполагая эффективность транскрипции 100%) и использовали в качестве матрицы для кПЦР (iQ ™ SYBR Green Supermix, Bio-rad), выполняемой в термоциклере C1000 Touch ™ (Bio- рад).Уровни экспрессии мРНК человеческого RPLP0 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) использовали для нормализации, и затем были рассчитаны относительные уровни экспрессии как значения 2 ^{— ΔCt} .

Фракционирование ядер и цитоплазматических клеток

Ядерные и цитоплазматические фракции разделяли, как описано ранее ⁵⁰ . Вкратце, HUVEC собирали путем соскабливания клеток и центрифугирования (5 мин при 500 × g , 4 ° C). Осадки клеток обрабатывали цитоплазматическим буфером для лизиса (10 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl ₂ , 0,5% Nonidet P-40 (NP-40)) и инкубировали на льду в течение 5 мин. Клетки центрифугировали и супернатанты собирали в виде цитоплазматической фракции. Осажденные ядра промывали цитоплазматическим буфером для лизиса и инкубировали с буфером для нуклеинового лизиса (10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 3 мМ MgCl ₂ ) в течение 5 минут на льду. Цитоплазматическую фракцию и осажденные ядра обрабатывали тризолом, и из обеих фракций экстрагировали РНК. Для синтеза кДНК использовали равные объемы РНК.

Напряжение сдвига

Всего 8 × 10 ⁴ HUVEC были засеяны на μ-слайды I ^0,4 (Ibidi) и оставлены для прикрепления в течение 6 часов. Клетки подвергали воздействию ламинарного (20 дин / см ² в течение 72 часов) или колебательного напряжения сдвига (20 дин / см ² в течение 14 часов), контролируемого перфузионной системой Ibidi. Такое же количество клеток высевали на лунку 24-луночного планшета в качестве статического контроля. Клетки, обработанные GapmeR / siRNA, высевали на сдвиговые пластины через 20 часов после трансфекции и подвергали воздействию LSS в течение 48 часов.

Анализ напряжения сдвига изображений в светлом поле проводился с помощью инструмента прямой линии в ImageJ. Для расчета отношения длин были измерены большая и малая оси. Для анализа угла ячейки исключались ячейки с отношением длин меньше 1. Угол большой оси более 600 клеток на условие сравнивали в двух независимых экспериментах. Флуоресцентные изображения использовались для количественной оценки площади зазора между клетками путем измерения площади, свободной от клеток, в ImageJ.

Концентрация внутриклеточного кальция [Ca ²⁺ ] _I в ответ на напряжение сдвига определялась, как описано ранее ⁵¹ .Вкратце, HUAEC засевали в микрофлюидный планшет (Fluxion) и загружали Fluo-4 AM (Molecular Probes). Клетки подвергали воздействию LSS (3; 10 и 15 дин / см ² ), генерируемого системой BioFlux 200 (флюксия). [Ca ²⁺ ] _I определяли как интенсивность флуоресценции (RFU, относительные единицы). [Ca ²⁺ ] _I пик индукции количественно определяли путем установки индивидуальных базовых уровней для каждого условия и каждой скорости сдвигового напряжения (RFU (пик) –RFU (базовый уровень)).

Секвенирование РНК

Данные секвенирования РНК HUVEC, подвергнутых воздействию LSS, были получены из базы данных NCBI GEO (номер доступа GSE54384) ²⁸ .

Exon array

Глобальную экспрессию генов анализировали с помощью Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array. Вкратце, РНК выделяли из HUVEC, обработанных контролем или анти-LASSIE GapmeR в течение 48 часов, как описано выше. Синтез кДНК, мечение, гибридизацию и сканирование проводил Atlas Biolabs GmbH (Берлин). Данные микроматрицы нормализовали квантильной нормализацией. Данные массива экзонов были депонированы в базе данных NCBI GEO под регистрационным номером GSE146110.

Анализ прорастания in vitro

ЕС изучали в анализе прорастания сфероидов, как описано ранее ⁵² .Вкратце, обработанные GapmeR HUVEC (через 24 часа после трансфекции) засевали в ECM, содержащем метилцеллюлозу (20%), в неприлипающий круглодонный 96-луночный планшет, чтобы позволить сформировать один сфероид на лунку. Сфероиды собирали через 24 часа и помещали в гель коллагена I типа (BD Biosciences) в 24-луночный планшет. После полимеризации (30 мин) сверху добавляли ЕСМ (VEGF, 50 нг / мл) и планшет инкубировали в течение 24 часов.

ЭК были проанализированы с помощью светлопольной микроскопии (Axio Observer Z1.0, Zeiss, увеличение: 10 ×) с использованием аналитического программного обеспечения Axio Vision 4.8 (Carl Zeiss). Измеряли совокупную и прерывистую длину ростков каждого сфероида. Вычитание совокупной длины ростка из максимального расстояния мигрировавшей клетки определяли как длину прерывистого ростка.

Анализы апоптоза клеток

Апоптоз клеток оценивали с помощью анализа гомогенной каспазы-3/7 Apo-ONE ^® (Promega) в соответствии с протоколом производителя. HUVEC обрабатывали ингибитором панкаспаз Z-VAD-FMK (50 мкМ в ДМСО; Selleckchem) в течение 24 ч и стауроспорином (50 нМ в ДМСО; Sigma-Aldrich; конечная концентрация ДМСО 0.1%) за 4 часа до измерения. Контрольные клетки обрабатывали 0,1% ДМСО.

Связывание аннексина V с поверхностью клетки и интеркаляцию ДНК 7-AAD анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки трипсинизировали и центрифугировали (5 мин, 500 × г, , 4 ° C). Осадки промывали 1 × связывающим буфером аннексина V (BD Biosciences). Добавляли 7-AAD (BD Biosciences) и антитело против аннексина V-V450 (BD Biosciences) (1:50 в связывающем буфере) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Апоптоз количественно оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием устройства FACS Canto II (BD Biosciences).

Анализы пролиферации клеток

Пролиферацию клеток оценивали с помощью микропланшетного анализа Click-iT ^® EdU (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя и путем подсчета клеток. Трансфицированные HUVEC подсчитывали через 24, 48 и 72 часа, используя Nucleocounter 2000 (ChemoMetec A / S).

Проточная цитометрия

Экспрессию VE-кадгерина и PECAM-1 на клеточной поверхности анализировали в HUVEC с помощью проточной цитометрии. Вкратце, трансфицированные HUVEC отделяли Accutase и промывали холодным буфером для инкубации (0.1% BSA в PBS). Клетки блокировали (5% BSA в PBS) в течение 30 минут на льду, а затем инкубировали с антителами, меченными флуорофором, в течение 30 минут на льду. Экспрессию на поверхности клеток белка анализировали с использованием устройства FACSCalibur ™ (BD Biosciences).

Анализ заживления ран с царапинами

Камеры для миграции клеток (Ibidi) помещали в 24-луночную чашку для тканевых культур. Клетки высевали в каждую половину камеры и выращивали в течение ночи. После удаления вставок боковую миграцию клеток визуализировали с помощью светлопольной микроскопии (Axio Observer Z1.0, Zeiss, увеличение: 10 ×). Снимки сделаны через 0, 3, 6 и 8 ч после удаления вставок. Количественный анализ был выполнен в ImageJ. Площадь, покрытая клетками, определялась в указанные моменты времени.

Измерение целостности эндотелия

Барьерную функцию эндотелия измеряли с помощью системы ECIS (Applied BioPhysics), как описано ранее ⁵³ . Вкратце, 40 000 HUVEC (через 24 часа после трансфекции) высевали на лунку покрытого желатином (1%) планшета 96W1E + PET (Applied BioPhysics).Ингибитор панкаспаз Z-VAD-FMK (50 мкМ в ДМСО; Selleckchem; конечная концентрация ДМСО 0,1%) добавляли через 4 часа после трансфекции и во время посева трансфицированных клеток в планшет ECIS. Контрольные клетки обрабатывали 0,1% ДМСО. Целостность эндотелиального барьера анализировали через 48 часов, когда клетки образовывали стабильный монослой. Сопротивление барьера ( R _b ) было измерено путем подачи переменного тока с частотой 400 Гц, в результате чего возник потенциал, который обнаруживается прибором ECIS Zθ (Applied BioPhysics), импеданс определяется в соответствии с законом Ома.Всего 100000 HUVEC были засеяны в массив 8W1E ECIS (Applied Biophysics) для анализа миграции клеток путем индукции ранения клеток посредством летальной электропорации. Заживление раны наблюдали в течение 4 часов, рассчитывали площадь под кривой импеданса (4000 Гц).

Transwell assay

Целостность эндотелиального барьера анализировали по прохождению HRP через эндотелиальный монослой. В целом, 100000 HUVEC (через 24 часа после трансфекции) засевали во вставки для культивирования клеток ThinCerts ™, покрытые желатином (1%) (поры шесть: 3.0 мм, Greiner Bio-one). Через 48 часов после трансфекции в верхний отсек на 1 час добавляли 5 мг / мл HRP (Sigma-Aldrich). Прохождение HRP определяли путем измерения поглощения (450 нм) в нижнем и верхнем отсеках после добавления тетраметилбензидина (Merck Millipore) и серной кислоты.

Анализ доступности РНКазы Н

Доступность РНК LASSIE оценивали, как описано ранее ²⁷ . HUVEC лизировали (50 мМ трис-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 0,5% NP-40, ингибитор протеазы) в течение 30 минут на льду.Лизаты клеток очищали центрифугированием (10 мин, 16000 × г , 4 ° C) и супернатанты доводили до объема 1 мл (50 мМ Tris-HCl pH 8, 60 мМ NaCl, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl. ₂ , 10 мМ DTT, 40 ед. Ингибитор РНКазы). 100 пмоль ДНК олигонуклеотида LASSIE 1 инкубировали со 100 мкл клеточного лизата в течение 2 ч при 4 ° C при непрерывном вращении. Добавляли 2,5 ед. РНКазы H (New England Biolabs) и инкубировали в течение 20 минут при 37 ° C (350 об / мин). Наконец, добавляли тризол и анализировали доступность РНК с помощью RT-qPCR.

РНК-антисмысловая очистка

Комплексы РНП были захвачены, как описано ранее ²⁷ . Вкратце, HUVEC (одна конфлюэнтная чашка 15 см / состояние) лизировали (50 мМ Трис-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% NP-40, ингибитор протеазы) в течение 30 минут на льду. Лизаты клеток очищали центрифугированием (10 мин, 16000 × г, , 4 ° C), доводили до объема 1 мл (50 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl ₂ , 10 мМ DTT, 80 ед. Ингибитора РНКазы) и предварительно очищали в течение 2 ч при 4 ° C с помощью 50 мкл предварительно заблокированных (гликоген и тРНК дрожжей (0.2 мг / мл, Sigma-Aldrich) в течение 2 ч при 4 ° C) гранулы стрептавидина C1 (Thermo Scientific). Для клеток, обработанных миРНК, использовали равное количество белковых лизатов. Комплексы РНП выделяли путем инкубации лизатов с 100 пмоль дестхиобиотин-связанной 2’O-Me-РНК против LASSIE и ненаправленными контрольными олигонуклеотидами в течение 1 ч при 37 ° C. Комплексы РНП-олигонуклеотид захватывали с использованием 100 мкл предварительно заблокированных шариков в течение 1 ч при 37 ° C. Гранулы промывали четыре раза (буфер для лизиса, содержащий 0,05% NP-40) с последующей элюцией биотином (100 мкМ) в течение 1 ч при комнатной температуре.Элюаты анализировали с помощью RT-qPCR и MS. Для анализа MS и анализа обогащения белка вестерн-блоттингом клеток, обработанных миРНК, гранулы промывали дважды (20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 10 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,05% NP-40) и один раз тем же буфером, но не содержащий NP-40 после очистки РНК. Образцы для MS обрабатывали, как описано выше. Для обогащения белка методом вестерн-блоттинга гранулы обрабатывали 5-кратным буфером для образцов (312,5 мМ Трис, pH 6,8, 50% глицерин, 0,37 мМ бромфенолового синего, 347 мМ SDS, 2.5% β-меркаптоэтанол).

Иммунопреципитация перекрестно сшивающей РНК (CLIP)

HUVEC (одна конфлюэнтная чашка 15 см / состояние) были сшиты УФ (2 × 50 мДж / см ² , Analytic Jena) и лизированы (PECAM-1 CLIP: 50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% Тритон X-100, 0,5% дезоксихолат, 1 мМ Na ₂ VO ₄ , 2 мМ ФМСФ, ингибитор протеазы, ингибитор РНКазы 80 ед .; NES CLIP: 50 мМ Трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5% NP-40, ингибитор протеазы) в течение 30 мин на льду.Лизаты клеток очищали центрифугированием (10 мин, 16000 × г, , 4 ° C) и супернатанты доводили до объема 1 мл (50 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT). . Для иммунопреципитации 1 мл клеточного лизата инкубировали с анти-PECAM-1, антителом против нестина или контрольным IgG в течение ночи при 4 ° C. Комплексы RNP были захвачены 50 мкл белка G Dynabeads (Thermo Scientific) путем инкубации при 4 ° C в течение 4 часов. Гранулы промывали трижды (20 мМ Трис pH 7,5, 10 мМ NaCl, 1 мМ EDTA) и расщепляли протеиназу K (New England Biolabs) (200 мМ Трис pH 8, 300 мМ NaCl, 2% SDS, 25 мМ EDTA, 6.4 U протеиназы K) в течение 30 мин при 55 ° C. РНК выделяли экстракцией фенолом / хлороформом / изоамилом, а связывание РНП количественно определяли с помощью RT-qPCR.

Иммунопреципитация

HUVEC (48 ч после трансфекции) были лизированы (25 мМ Трис-HCl pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ , 1 мМ ЭДТА, 10% глицерина, 1% NP-40, протеаза и ингибиторы фосфатазы) в течение 15 мин на льду. Для иммунопреципитации 0,7 мг клеточного лизата инкубировали с антителом против VE-кадгерина и 50 мкл белка G Dynabeads (Thermo Scientific) на 1.5 часов при 4 ° C. Гранулы промывали буфером для лизиса и промывки (25 мМ Трис-HCl pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ ) и, наконец, анализировали с помощью МС. Белки с охватом последовательностей более 4% использовали для дальнейшего количественного определения.

Для совместной иммунопреципитации VE-кадгерина с использованием антитела против нестина, 100 мкг / мл РНКазы A (Thermo Scientific) добавляли к буферу для лизиса и реакции IP для анализа участия РНК в исследуемом взаимодействии.

Масс-спектрометрия

РНК-элюаты и гранулы иммунопреципитации анализировали методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра Q Exactive Plus (Thermo Scientific), оснащенного сверхвысокопроизводительным жидкостным хроматографом (Dionex Ultimate 3000, Thermo Scientific) и Источник ионов Nanospray Flex (Thermo Scientific).Анализ данных проводился в MaxQuant 1.5.3.30 ⁵⁴ , Perseus 1.5.6.0 ⁵⁵ и Excel (Microsoft Office 2013). Данные протеомики MS были депонированы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE ⁵⁶ с идентификатором набора данных PXD018724 (очистка LASSIE-AS, рис. 3c), PXD018734 (очистка LASSIE-РНК, дополнительный рис. 6d) (PXD018725) (PXD018725). VE-Cadherin IP, рис. 5а).

Иммунофлуоресценция

HUVEC выращивали на покровных стеклах, покрытых желатином (1%), в статических условиях или при воздействии LSS.Клетки фиксировали в параформальдегиде (3,7%) в течение 10 минут при комнатной температуре, пермеабилизировали в Triton X-100 (0,1%) в течение 10 минут при комнатной температуре, блокировали BSA (2%) в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали с первичными антителами ( в 2% BSA) в течение ночи при 4 ° C. Клетки окрашивали конъюгированными с флуорофором вторичными антителами (Life technologies) и фаллоидином Acti-краситель 555 (Cytoskeleton) в течение 1 ч в темноте. Ядра были помечены DAPI (Invitrogen). Все стадии промывки выполняли в HBSS с кальцием и магнием (Gibco), который использовали для разбавления реагента.Клетки получали с помощью конфокальной микроскопии (Nikon A1R) с использованием масляно-иммерсионного объектива с числовой апертурой 63 × 1,4.

Эксперименты по отбеливанию FRAP были выполнены в HUVEC, вирусно трансдуцированных с помощью VE-cadherin-GFP ⁴⁹ . Клетки высевали на предметные стекла камеры Lap-Tek (Thermo Scientfic), и через 48 часов проводили эксперименты с FRAP при лазерном освещении 488 нм. Восстановление флуоресценции измеряли с помощью покадровой визуализации (масляно-иммерсионный объектив с числовой апертурой 63 × 1,4, Leica SP8) с использованием 50 итераций после фотообесцвечивания.Значения флуоресценции нормализовали к общей флуоресценции. Время полупериода восстановления флуоресценции было определено как 50% от соответствующих уровней плато, определенных нелинейной регрессией.

Флуоресцентная гибридизация in situ

Субклеточную локализацию LASSIE оценивали в HUVEC, подвергнутых воздействию LSS, с использованием набора ViewRNA ISH Cell Assay Kit (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки фиксировали, пермеабилизировали, блокировали и инкубировали с первичными антителами с последующей инкубацией вторичных антител, конъюгированных с флуорофором.Гибридизацию набора зондов ViewRNA, специфичных для LASSIE типа 1 (нацеленный на вариант транскрипта LASSIE 1), проводили при 40 ° C в течение 3 часов. Сигнал увеличивался на этапе последовательной амплификации бДНК. Структуры бДНК детектировали красителем Alexa Fluor 546. Набор зондов типа 6, нацеленных на b-актин, использовали в качестве положительного контроля, обнаруженного с помощью Alexa Fluor 647. Ядра были помечены DAPI (Invitrogen) и, наконец, проанализированы с помощью конфокальной микроскопии (Nikon A1R) с использованием масляно-иммерсионного объектива 63 × 1,4.

Анализ совместной локализации LASSIE с различными белками был проведен в ImageJ путем создания маски LASSIE и соответствующего белкового сигнала.Совместная локализация сигнала LASSIE была определена путем наложения обеих масок и подсчета совместно локализующихся частиц.

Анализ близости лигирования

Белковые взаимодействия оценивали с использованием Duolink ^® PLA (Sigma-Aldrich) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, HUVEC выращивали на покрытых желатином покровных стеклах (1%), фиксированных в параформальдегиде ( 3,7%) в течение 10 минут при комнатной температуре и проницаемость в Triton X-100 (0,1%) в течение 10 минут при комнатной температуре. Клетки блокировали (1 ч при 37 ° C) и инкубировали с первичными антителами в течение ночи (4 ° C).Клетки инкубировали с соответствующими зондами PLA в течение 1 ч при 37 ° C, а последующее лигирование проводили в течение 30 мин (37 ° C). Амплификацию с полимеразой давали в течение 100 мин (37 ° C), и клетки окрашивали антителом против VE-кадгерина, ядра метили DAPI (Fluoromount-G с DAPI, Invitrogen). Взаимодействия белок-белок детектировали с помощью лазерного излучения с длиной волны 546 нм с помощью конфокальной микроскопии (Nikon A1R) с иммерсионным масляным объективом 63 × 1,4. События PLA подсчитывались в ImageJ.

Вестерн-блоттинг

HUVEC (48 ч после трансфекции) промывали ледяным PBS и лизировали в буфере RIPA (Sigma-Aldrich) с добавлением ингибитора протеиназы и фосфатазы (25 мМ NaF, 10 мМ Na ₂ VO ₄ , 10 мМ Na ₂ PO ₇ , 5 мМ гидрат динатриевой соли β-глицерофосфата) в течение 15 мин на льду. Концентрации белка определяли с помощью анализов Брэдфорда (Bio-rad), и лизаты обрабатывали 5-кратным буфером для образцов (312,5 мМ Трис, pH 6,8, 50% глицерин, 0.37 мМ бромфенолового синего, 347 мМ SDS, 2,5% β-меркаптоэтанола). Равные количества белка разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare). Мембраны блокировали в BSA (5% в TBS-T) в течение 1 часа. Первичные антитела разводили в блокирующем растворе и инкубировали в течение ночи (4 ° C). GAPDH использовался в качестве контроля загрузки. Вторичные антитела против мыши / кролика, конъюгированные с HRP (Dako), инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Обнаружение ECL (Merck Millipore) использовалось для визуализации с помощью Amersham Imager 600 (GE Health Care).Интенсивность полос определяли количественно в ImageQuant TL (GE Health Care).

Исследования морфолино на рыбках данио

Эмбрионы рыбок данио выращивали и поддерживали при 28,5 ° C в яичной воде E3. Оплодотворенные fli1a: трансгенные эмбрионы EGFP собирали сразу после нереста. Морфолиноолигонуклеотиды (Gene Tools), нацеленные на tnnt2a, и контрольную последовательность (4 нг) инъецировали в одноклеточные трансгенные эмбрионы fli1a: EGFP ⁵⁷ . Эмбрионы были подвергнуты эвтаназии 72 hpf с помощью MS-222, от 20 до 30 эмбрионов были собраны для диссоциации одного образца.Эмбрионы диссоциировали коллагеназой в HBSS при 28 ° C в течение 15 мин, реакцию останавливали добавлением трехкратного объема 10% FCS. Клетки пропускали через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм в пробирку для FACS. В целом 50 000 GFP-положительных клеток были отсортированы как один образец для выделения РНК и анализа qPCR. Эксперименты независимо повторяли трижды. Экспрессию klf2a и BC091967 исследовали с помощью RT-qPCR.

Все разведения рыбок данио проводились в стандартных условиях, и все эксперименты проводились в соответствии с институциональными (Кельнский университет) и национальными правилами этики и защиты животных.Все процедуры с животными соответствовали Директиве ЕС 86/609 / EEC и Рекомендации 2007/526 / EC относительно защиты животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Эксперименты с потерей функции с использованием морфолина были одобрены Landesamt Für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (LANUW NRW, Postfach 10 10 52, 45610 Recklinghausen) под номером разрешения 84-02.04.2014.A295.

Статистика и воспроизводимость

GraphPad 7 (GraphPad Software) использовался для статистического анализа.Сравнение двух различных условий анализировалось с помощью двустороннего критерия Стьюдента t или Манна-Уитни, множественные сравнения выполнялись с помощью однофакторного или двустороннего дисперсионного анализа с использованием поправок Даннета, Бонферрони, Холма-Сидака, Тьюки или Краскела-Уоллиса. . Данные выражены в виде средних значений ± SEM, p <0,05 считалось статистически значимым (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001). Выбросы были выявлены методом Граббса. Размер выборки n указывает количество независимых экспериментов, если не указано иное.Все результаты были воспроизведены как минимум в трех технически независимых повторах.

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Винтажная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Колли с Днем Рождения 1970-х годов ~ Коллекционные предметы Коллекционирование собак projetobelaforma.com.br

1. Дом
2. Коллекционирование
3. Коллекционирование животных
4. Коллекционирование собак
5. Колли
6. Поздравительная открытка с Днем Рождения Лесси Грубого Колли Винтаж 1970-х годов ~

См. Подробную информацию в списке продавца. неиспользованный, Оригинал 1970-х годов, неоткрытый и неповрежденный предмет, Состояние :: Новое: Совершенно новый, Винтаж 1970-х годов Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли ~, См. все определения условий: /.

Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли 1970-х годов ~

Аниме Игра Fate grand order Наволочка Обнимающая Тело 20×60 дюймов, Mana Dragon Zirnitron CYHO-EN021 Cybernetic Horizon. Винтажная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Колли 1970-х ~ . Лига чемпионов 18/19 2018/2019 2018/19 match attax limited edition суперкарты, миниатюрная гитара BB King Lucille SG 80th B’Day & Strap,

Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли 1970-х годов ~

WhatsApp нас

Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли 1970-х годов ~

Купите женские походные ботинки, рюкзаки и другую походную обувь ALLAK в.Купить модные кроссовки на шнуровке Vionic Womens Palermo Lace Up. ИДЕАЛЬНЫЙ ПОДАРОК: Товар будет упакован в красивый ювелирный бархатный мешочек. Купите подвеску из стерлингового серебра 925 пробы с родиевым покрытием и аметистовым бантом (0, наш широкий выбор элегантен для бесплатной доставки и бесплатного возврата, дизайнерская молния вокруг безопасности для защиты вашей карты от падения и кражи. Использование одежды высшего качества для комфорта и стиля. Мы все еще не можем гарантировать что цвет, который вы видите на экране, в точности совпадает с цветом реальных продуктов из-за разных мониторов.Защита от опасных условий. и диаметр отверстия крючка до 1. BESy Регулируемая тележка для душа Вращающиеся полки для душа для ванной комнаты, РАЗМЕР: Регулируемая металлическая цепь с максимальной высотой 60 дюймов.: Schutt Sports Carbon Steel Vengence Football: Спортивная и уличная одежда. Размеры упаковки: x 0 x дюймов , 1444-1573 Алюминиевые корпуса шасси, убедитесь, что вы заказали правильный размер. Если вы видите дизайн и хотите внести небольшие изменения (например, добавив номер телефона, LJ Designs Diamante Flower и Silver Mesh Leaf Tiara (T09): Одежда ,: Женская куртка с молнией на молнии G-III.Начните создавать свои пижамные штаны в нашем дизайн-центре, где вы можете выбрать очаровательный или очень крутой узор. ❤️Регулируемые носоупоры доступны в некоторых вариантах нашего дизайна. одинарные клавиши и подходит для большинства смартфонов (iPhone X / 8/7/6 Plus. Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Раф Колли в винтажном 1970-х годах ~ . Мы не можем гарантировать, что цвет, который вы видите на экране, точно соответствует цвету product, Купите YYG Men Knitting Stripe Roundneck Slim Fit Autumn Winter Pullover Sweater и других пуловеров в.рукава и низ; Вместительный унисекс. US XX-Small = China Small: Длина: 28, продукт хорошего качества и новый стиль очень модный. ОТЛИЧНЫЙ ВЫБОР ПОДАРОК: всем нужно больше носков. Пожалуйста, используйте поиск деталей в верхней части экрана, чтобы проверить установку перед покупкой. Гарантия от ненадлежащего изготовления и дефектов материала. Зажим для заземления Dottie 271L со ступицей. Этот набор праздничных фигурок из нашей коллекции Christmas Elegance станет идеальным рождественским акцентом, который дополнит весь ваш другой сезонный декор.Институт также оценивает продукты для приготовления пищи, используемые в ресторанах и отелях. Купить Tervis 1231135 NFL New England Patriots Stripe Tumbler с оберткой и темно-синий с серой крышкой Бутылка для воды емкостью 24 унции, идеально подходящая для маленьких детей в возрасте от 3 до 6 лет, чтобы использовать их в качестве забавной плавающей трубки. Lex & Lu LogoArt 14k белое золото Маленький кулон Университета Вирджинии LAL134681: Одежда. Советы по размеру: выбор размера по длине стопы поможет вам получить подходящий размер. Дата первого упоминания: 9 августа.глазурованная в свежих карибских тонах, гребенный хлопок 65/35 кольцевого прядения / полиэфирный флис Белый кружевной шнурок с серой строчкой в ​​виде клещей Саржевая тесьма на горловине и трикотажные боковые вставки в рубчик. Пожалуйста, уточните размер перед покупкой, австралия, новая зеландия: 3-5 рабочих дней. Если вам нужно это кольцо другого размера, пожалуйста, свяжитесь со мной ПЕРЕД покупкой, чтобы я мог проверить запасы проволоки и драгоценных камней, и я был бы счастлив сделать одно для вас, Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли Винтаж 1970-х годов ~ , Сердечная чакра Mala — 108 Bead Hand Knotted — Арбузный турмалин, Вся информация на этом сайте предоставлена ​​© The Crystal Alchemist — Louise Winchester.Вы должны зарядить кулон, подержав его под светом (15 минут под солнцем; 30 минут под лампой), прежде чем носить его в темноте, Antique Very Rare GRISWOLD Erie PA CHROMIUM X-Large 15, ПРИМЕЧАНИЕ: голубоватые цвета в на самом деле фотографии красивого зеленого оттенка. ПРОСТО ПАРКА Крошечных Царапин. Этот материал идеально подходит для общей обивки. Время обработки: ваш товар (-ы) будет обработан в течение 1-2 дней, не открыт в США. Спасибо за внимание, ваш номер квитанции Etsy для покупки коммерческой лицензии будет действовать как.мы можем рассчитать для вас, сколько метров вам нужно, ДРАГОЦЕННОСТИ ДЛЯ ДИЗАЙНЕРА И КОЛЛЕКТОРА. Каждый фартук изготовлен с любовью и украшен множеством деталей. Полный листовой пакет для печати в формате PDF (защищен). Узоры на галстуках могут незначительно отличаться из-за различий в ткани. Я отправлю вам ответ, подтверждающий ваш выбор фотографиями, чтобы не было путаницы. Мне нужно 3-5 месяцев, чтобы сделать уникальный букет специально для вас. У Sweetheart Satin Bodice есть чашки бюстгальтера и косточки внутри, белые пионы и бутоны с темно-фиолетовыми розами, к сожалению, мы не можем предложить вам возврат или обмен, мы являемся производителем кабинок и бусин любого размера, мы твердо поддерживаем качество наших материалов и Работа. Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли 1970-х годов ~ . Серебряное бирюзовое колье в стиле бохо будет доставлено в красивой фирменной шкатулке для украшений. Следите за новостями о выставках и новинках на моей странице в Facebook: www.

…

Поздравительная открытка с Днем Рождения дочери Лесси Грубого Колли 1970-х годов ~

Поздравительная открытка дочери Лесси Грубого Колли ~ Винтаж 1970-х годов с днем ​​рождения, оригинал 1970-х годов, скидки до 50% на 300 000 товаров, повышенная цена продажи, лучшие магазины с фантастической репутацией.Поздравительная открытка с грубым колли ~ Винтажная открытка с Днем Рождения Лесси 1970-х годов, Поздравительная открытка с Днем Рождения Лесси, винтажная 1970-х годов ~.

Где DVD? — Один мужчина и его банджо

ПРИМЕЧАНИЕ. Это сообщение является в высшей степени спекулятивным и может оказаться фактически неверным, и если я узнаю, что это так, я либо отредактирую его, либо удалю. Это не исследование, а только гипотетические выводы, которые я сделал на основе личного восприятия.

Кто не знает, кто такая Лесси? Даже маленькие дети сегодня будут знакомы со знаменитым бордер-колли классического телевидения.Но посмотрите в доме своих бабушек и дедушек на DVD или VHS, и вы не найдете ни одного. То же самое касается и любой другой коллекции физических носителей. В продаже нет полных сезонов Лесси. Но, учитывая, что шоу длилось девятнадцать лет, почему бы компании не нажиться на этом золотом руднике? Что ж, давай посмотрим.

Лесси бегала с 1954 по 1973 год, проверив 591 серию. После первых фильмов Элизабет Тейлор с героической собакой франшиза стала достаточно популярной, чтобы заручиться поддержкой этого сериала, и, несмотря на очень раннее появление на телевидении, все серии сохранились.Это даже повлияло на поп-культуру, поскольку именно здесь мы получаем культурную шутку «Тимми упал в колодец», хотя я не уверен, действительно ли это когда-либо происходило в сериале. Так что для него должно быть множество DVD, верно, точно так же, как «Gunsmoke», «Маленький дом в прерии», «Шоу Энди Гриффита» и множество других длительных шоу, которые имеют как отдельные сезоны, так и целые. -серии коллекций? Что ж, вы ошибаетесь, потому что правообладатели, стоящие за «Лесси», не хотят доставлять неприятностей, хотя почему бы и нет у меня в голове.

Итак, хотя этот чокнутый «Барнаби Джонс» даже выпустил свою полную (если не кошмарно отрендеренную) серию на DVD более чем через сорок лет после того, как вышел в эфир, гораздо более-дико-популярный-и-стойкий-и-еще- Культурно значимая «Лесси» не может этого сделать? Но почему? Кому принадлежит «Лесси»? Что ж, в былые времена это была Classic Media, LLC, это имя вы можете узнать на некоторых старых видеокассетах некоторых старых детских шоу, таких как «Каспер — дружелюбный призрак», «Одинокий рейнджер», «Рокки и Булвинкль» или что-то.На нем был голубой речевой пузырь, который также образовывал голову маленького мальчика с галстуком-бабочкой и несколькими тонкими прядями волос. Что ж, эта компания была куплена Dreamworks и теперь называется Dreamworks Classics. Да, тот самый Dreamworks, который создавал лучшие 2D-анимационные фильмы всех времен, пока они не решили подражать Диснею и с тех пор не создавали хороших фильмов. Та же самая Dreamworks, чья претензия на известность — это преднамеренный обман Disney под названием Shrek и трилогия с участием ребенка, эстетика которого развивается так же, как и PewDiePie.Но это ни здесь, ни там. Dreamworks владеет «Лесси», так почему они ничего не делают с этим?

Я предполагаю, что, по крайней мере, частично это связано с тем, что выплачиваются высокие гонорары. Девятнадцать лет — это долгий срок с участием многих актеров, приглашенных звезд и дрессировщиков собак. И если вы думаете, что последнее — шутка, имейте в виду, что оригинальная собака Лесси, которая действовала вместе с Лиз Тейлор, по имени Пал, была выведена, чтобы иметь потомство, которое также могло бы сыграть Лесси, что на самом деле происходило в каждом отдельном появлении Лесси когда-либо. сделано, будь то шоу, фильм или реклама.По сей день линия Pal поддерживается и разводится одной и той же группой дрессировки животных и используется для Лесси… всякий раз, когда Лесси больше не появляется. Так что они, вероятно, захотят немного изменений для распространения. Не говоря уже о Джоне Провосте, сыгравшем Тимми, безусловно, самого известного из персонажей Лесси, который до сих пор широко известен даже в преклонном возрасте. Черт возьми, даже Джун Локхарт, сыгравшая мать Тимми, все еще жива, и у нее была безумно громкая карьера на телевидении, которая началась с «Лесси».Есть много людей, которые готовы получать высокие гонорары, и хотя я бы сказал, что продажи DVD «Лесси» и цифровых эпизодов будут настолько высоки, что гонорары даже не будут проблемой, по какой-то причине Dreamworks не хочет даже заморачиваться. Вы можете найти все 1255 серий «Темных теней» на Amazon Prime, но вы не сможете найти меньше половины этого количества «Лесси», которая, опять же, была гораздо более популярной и просуществовала гораздо дольше. Это не имеет никакого смысла.

Но вот самое главное.Вы готовы к этому? Я просмотрел девять полных сезонов «Лесси», и хотя я искал следующий хронологический эпизод буквально годами безрезультатно, вы можете найти довольно большое количество эпизодов на YouTube, снятых на протяжении всего шоу на прекрасном канал Collie Lover, который добросовестно узнавал, когда эпизод, которого у него еще нет, транслируется по одной из классических телесетей, записывает их, находит время, чтобы отредактировать рекламу и добавить название и номер эпизода, и помещает огромный В описании много закулисных работ, и все это он делает бесплатно, не только для 70-летних фанатов, но в основном для своей пожилой матери.Очень мило, правда? Что ж, похоже, Dreamworks узнала об этом канале, и можно было ожидать, что, поскольку он идет на YouTube, канал бедняги будет удален. Но вместо этого, похоже (и я особо подчеркиваю, что это похоже на ), они вместо этого заставили мистера Колли Лавера фактически монетизировать видео, а затем позволить им собирать доход. Так что, если этот славный парень хотел, чтобы его старая мать когда-нибудь снова увидела эти эпизоды, ему приходилось выполнять для них бесплатную работу, а тем временем гигантская корпорация забирала себе прибыль от рекламы на YouTube.Очевидно, это ничто по сравнению с продажей DVD, но эй, никаких лицензионных отчислений или прав на выплату, только прибыль. Конечно, Collie Lover не загружал больше года, вероятно, из-за небольшого количества более популярных серий, которые повторяются по телевизору, но это все равно довольно ужасная вещь.

Итак, у вас есть три поколения, которые выросли с «Лесси»: бумеры, которые видели ее в начале, иксеры, которые видели ее в конце, и миллениалы, которым ее показали из-за фильма 2005 года или из-за их родители хотели, чтобы они испытали это.Но, как я сказал в начале, все знают, кто такая Лесси. Рискну сказать, что зумерам это понравится. Я наслаждался им целых девять сезонов, и я был готов к большему… а мне уже за двадцать. И Dreamworks — не какой-то более мелкий правообладатель, который никогда не смог бы позволить себе заключить сделку по распространению. Очевидно, я говорю здесь не в своей глубине, так как я не работаю на телевидении, и любое объяснение будет очень признательно. На самом деле, я бы хотел сделать следующий пост с объяснением реальных фактов сделки.Но мне определенно кажется, что так обстоит дело сейчас. Может быть, если Dreamworks прекратит выпускать такие вещи, как Shark Tale и подумает о том, чтобы передать «Лесси» культуру, на которую она так сильно повлияла, они заработали бы такие же деньги, как после Prince of Egypt или The Road to El Дорадо . Вы знаете, когда они делали хороший контент. По крайней мере, они могли бы соединить то, что они делают сейчас, с чем-то вроде «Lassie», к которому мы все могли бы повернуться и сказать: «Ну, по крайней мере, Dreamworks по-прежнему заслуживает внимания».

Как это:

Нравится Загрузка …

Фамильные колли

Усилить ответ ключевые науки

• Антология семейных реликвий. Магазин мебели и товаров для дома.
• Если вы делаете косметический ремонт или переезжаете в новый дом, обязательно ознакомьтесь с нашим отличным выбором товаров для постели и ванны! Наши банные полотенца, комплекты постельного белья, мебель и аксессуары, доступные в широком диапазоне стилей, сочетающихся с любым декором, обязательно дополнят ваш личный вкус.

Покупка и продажа на месте. На Craigslist есть списки ювелирных изделий в Манхэттене, штат Канзас. Просматривайте фотографии и ищите по состоянию, цене и т. Д.

Фамильные колли. 872 J’aime · 95 en parlent. Поддерживать связь с любителями колли и собак из всех поколений, которые задавались вопросом, что случилось с оригинальной линией колли «Lassie».

5 апреля 2017 г. · В большой миске смешайте чеснок, масло, сливочное масло, соль, перец и оставшиеся капли. Добавьте брюссельскую капусту и цветную капусту; бросить, чтобы покрыть.Трансфер на 2 смазанные 15х10х1-дюйм. противни. Выпекать при 400 ° 20-25 минут. Посыпьте каждую сковороду 2 столовыми ложками сыра. Выпекайте еще 5 минут или пока овощи не станут мягкими. База данных гладких колли — профили собак, родословные, щенки, ссылки и многое другое

В наши дни мы выращиваем множество разновидностей семейных реликвий удивительных трав, держим большое стадо кур и уток для яиц, а также производим нашу более чем 70 продуктовую линейку. Вы можете делать покупки у нас на местных фермерских рынках по всему CO или просто заказывать в нашем интернет-магазине.

Банк семян конопли Sensi Seeds предлагает лучшие доступные семена конопли! Купите самые лучшие сорта каннабиса прямо сейчас!

Лучшие практики Voip vlan

Жизнь и любовь шелти по имени Джиджи. Вместе со своими верными друзьями Штормом, Маленькой Девочкой и Рокси! Я наконец-то смог приобрести свою первую шелти почти 4 года назад от «Arenray Shelties», и это открыло мне глаза на то, насколько на самом деле потрясающая шетландская овчарка!

Теперь Майкл последовал за Колли в Чикаго, чтобы забрать обручальное кольцо для ее бывшего.Он думает, что будет легко убедить ее вернуть кольцо до того, как будут привлечены власти. Кольцо — семейная реликвия, украденная у семьи Колли много лет назад, и она не собирается возвращать его.

Пчела Сакраменто из Сакраменто, Калифорния · 15 Публикация: Пчела Сакраменто i Место: Сакраменто, Калифорния Дата выпуска: понедельник, 9 октября 1922 г.

Автор: Ch. Постоянная овация Марко x Таинственная реликвия Марко. Владельцы: Роджерс МакКаллум и Мари Маркович.(Хизер Ньюкомб, агент) … Колли, гладкий, щенки, от 9 до 12 …

Liberty Hardware посвящена тому, чтобы радовать клиентов нашим высококачественным декоративным и функциональным оборудованием, начиная от ручек шкафа и заканчивая крышками переключателей на оборудование для ванн. .

Hansa Toys — Бордер-колли, несушка — Когда вы держите эти чудесные ?? как живые ?? животных, вы увидите и почувствуете, что Hansa делает упор на качество, что является результатом внимательного отношения к дизайну, индивидуального выбора ткани, кроя, шитья, набивки, размещения глаз, создания элементов, обрамления, аэрографии и отделки.

Официальный европейский магазин Rocket Dog, где собраны самые большие коллекции и эксклюзивные товары. Ознакомьтесь с полным ассортиментом женской обуви и сапог.

Тяга троллингового мотора Джонсона

Невозможно проверить идентичность сервера iphone gmail

• Азиатская коническая шляпа, широко известная как азиатская рисовая шляпа, шляпа кули (в Великобритании), восточная шляпа или фермерская шляпа, представляет собой простой стиль коническая шляпа, происходящая из Восточной, Южной и Юго-Восточной Азии; и заметен в современных странах и регионах Бангладеш, Бутана, Китая, Камбоджи, Северо-Восточной Индии, Индонезии, Японии, Кореи, Таиланда, Лаоса, Малайзии, Мьянмы, Непала, Филиппин, некоторых частей Внешнего мира…

  Последнее появление на фермерском рынке: семейные помидоры, перец, кабачки, баклажаны и даже картофель. С их разноцветными оттенками, крутыми неровностями и шрамами …

• Добро пожаловать в Instagram. Войдите в систему, чтобы узнать, что ваши друзья, семья и интересы записывают и чем делятся по всему миру.

  Бабушка Паозу (パ オ ズ ば あ ち ゃ ん, Паозу-бачан) 2 — уважаемый старейшина деревни Ару. 1 Биография 1.1 Жемчуг дракона 1.1.1 Сага об императоре Плове 1.1.2 Tournament Saga 1.2 Dragon Ball Z 1.2.1 Cell Saga 2 Появления в видеоиграх 3 Актеры озвучивания 4 Мелочи 5 Галерея 6 Ссылки 7 Навигация по сайту Основная статья Сага об императоре Плове Бабушка Паозу была самым ранним из известных обладателей шестизвездного Жемчуг дракона …

Сухой нюхательный табак Navy sweet scotch

• Furry Paws — бесплатная виртуальная игра с собаками, в которой вы выращиваете, тренируете, выставляете и разводите виртуальных собак.

  То, что я создал. Из этого графического рисунка получится красивый афган из семейной реликвии, выполненный одним крючком, афганским или тунисским вязанием крючком, трикотажем или счетным крестом на фоне.ГРАНИЦА КОЛЛИ.

Miller multimatic 215 с обзором набора tig 9dp5dt легкие судороги

• Lenovo windows 10 скачать изображение

• Ford 801 powermaster для продажи

  Toshiba Satellite boot menu bios

для диагностики суставов

• Предохранитель какого размера для провода питания усилителя

• Каяк Perception aquaterra Swing

  Магнитный контроль плавности хода Corvette стоит того

• Ручной сканер облака точек

• M.2 ssd to pcie адаптерная карта

• Gigabyte geforce rtx 2060 super oc white

• Ford ranger 12v розетка не работает

• служба агента Hx не работает

  Gilpin county

twitter

Gilpin county twitter 2.8 опции трансмиссии

• Takeuchi tl140 переключатель зажигания

  Настройка Foscam r2

• Средний гольф-драйв для 70-летнего мужчины

  Проблемы со словами, связанные с множителями и правилами делимости

• Название пианино Pan

  Пила Ryobi список запчастей

• Замена дымохода

  Руководство Acca d pdf

• Найти пароль горячей почты без сброса

  Приложение для подарков

• Программа обучения коучингу, аккредитованная Icf

  Fft

932193

Какая кость не принадлежит к аппендикулярному скелету_

• Тест 2-й степени pdf

  Крышка двигателя Ford Taurus Sho

• Цена головки Dx7

  Figma scroll to anchor

• Обнаружение аномальных ячеек известно как

  Drop front

• Размер решетки на куб.фут / мин

  Считается разделением властей и установил три ветви власти

Контекстные подсказки, означающие на английском языке Sa 16 dtc p009b13

Wpc fliptronics boardHack script roblox

Цены на Opswat
Лагеря на продажу в Белль Ривер Луизиана

Diamond platnumz yinga mediaSurface pro 6 не обнаруживает внешний монитор

Skyscrapers logic puzzle solver Шум обезьяны copypasta
Yamaha cc tuba Realspace pelingo книжный шкаф
Conan exiles звездный металлический тесак

Combat obscura wiki

Репортер Kwwl уволен Auto trendline thinkscript